BRAF检测失败的原因有哪些？—— 华山医院检验科专家为您解析
你知道吗？大约有8%-12%的结直肠癌患者存在BRAF V600E突变，这个数字背后，是明确的预后提示和潜在的治疗选择分叉口。但有时候，我们检验科医生会收到临床的反馈：“这次的BRAF检测怎么没做出结果？” 这确实让人头疼。今天，咱们就坐下来好好聊聊，BRAF检测失败的原因有哪些？ 弄明白这些，无论是对于临床决策，还是对于患者后续的治疗安排，都太重要了。
导语：理解BRAF检测失败对结直肠癌精准诊疗的意义
BRAF V600E突变在结直肠癌里，尤其在西妥昔单抗等EGFR抑制剂疗效预测和预后判断上，是个“坏消息”标志物。它往往提示预后较差，且对部分靶向治疗原发耐药。所以，准确检测出它，是制定精准治疗方案的第一步。可这一步要是卡住了——检测失败了或者结果不明确，整个诊疗节奏都可能被打乱。所以，系统性地搞清楚 “BRAF检测失败的原因有哪些？” ，绝不是技术员的“自说自话”，而是关乎临床实效的关键问题。
样本质量问题是导致BRAF检测失败的首要原因
聊到失败原因，十次里有六七次，问题都出在送到我们手里的那块组织上。样本是检测的源头，源头出了问题，后面再精密的仪器也白搭。
肿瘤细胞含量不足或DNA降解会影响BRAF检测结果。 这是最常碰见的场景。想象一下，我们要在一大群正常细胞里，找出几个携带突变基因的“坏蛋”肿瘤细胞。如果肿瘤细胞比例太低，比如低于检测方法要求的20%，突变信号就像一滴墨水掉进大海，被彻底稀释了，仪器根本“看”不见。这种情况在小的活检标本里特别常见。
还有，组织离体后的处理简直是“生死时速”。如果没及时用合适的固定液（比如中性福尔马林）浸泡，或者泡得太久（超过48小时），组织里的DNA就会断裂、降解，变得支离破碎。我们提取出来的都是一些短片段，根本没法进行后续的扩增和测序。有时候，送来的样本量就黄豆那么大一点，切完病理诊断用的片子后，留给分子检测的实在捉襟见肘，提取的DNA量连检测的最低门槛都达不到。你看，BRAF检测失败的原因，很多时候在样本进入实验室大门前就已经埋下了。
检测技术本身的局限性可能造成BRAF检测失败
当然，锅不能全让样本背。我们使用的检测技术本身，也不是万能的，各有各的“脾气”和短板。
检测方法灵敏度不足或引物设计问题可能导致BRAF突变漏检。 现在检测BRAF突变的方法很多，比如传统的Sanger测序、灵敏度高一些的ARMS-PCR，还有能测很多基因的高通量测序（NGS）。每种方法都有它的检测下限。Sanger测序大概要突变比例在20%以上才能稳定检出，如果肿瘤细胞比例不高，或者突变是混杂的（异质性），它就很可能漏掉。ARMS-PCR和NGS灵敏度高，能查到1%甚至更低的突变，但它们也怕“特殊情况”。
比如，我们设计用来抓取BRAF基因的“探针”或“引物”，它们结合的位置如果恰好存在一些罕见的基因多态性（可以理解为天然的基因序列个体差异），就可能结合不上，导致检测信号弱甚至没有。再比如，有些非常见类型的BRAF突变（非V600E突变），如果检测试剂盒的设计没有覆盖到，那自然也检不出来。所以，选择哪种检测方法，必须结合患者的具体情况和临床问题来定，没有“最好”，只有“最合适”。
操作流程与数据分析中的环节也不容忽视
样本合格，方法选对了，是不是就高枕无忧了？还真不是。从实验台到出报告，中间每一个手工和分析的步骤，都是潜在的“风险点”。
实验操作误差和生物信息学分析阈值设置不当影响BRAF检测成功率。 分子检测是个精细活。在DNA提取、文库构建、PCR扩增这一连串操作里，任何一个环节不小心引入了污染，或者加样量有偏差，都可能导致实验失败。我们实验室每天都要做大量的质控，比如阳性对照、阴性对照，就是为了监控整个流程是否跑偏。
到了NGS检测，湿实验结束，干实验（生物信息学分析）才开始。这里头有个关键参数叫“突变频率阈值”。简单说，就是设定一个百分比，高于这个值的信号才被认为是真突变。这个阈值设高了，可能会把那些真实的低丰度突变（比如只有2%的突变）给过滤掉，造成假阴性；设低了，又会把大量的背景噪音当成突变，导致假阳性满天飞。这个度的拿捏，非常考验分析人员的经验。所以，一份可靠的报告，是实验员和分析员共同把关的结果。回过头看，BRAF检测失败的原因有哪些？ 操作和数据分析这个“人”的因素，绝对不可忽视。
总结与建议：如何最大程度避免BRAF检测失败
聊了这么多，咱们来总结一下。BRAF检测失败的原因主要围绕三个方面打转：样本、技术和人。要想最大程度地避免失败，需要临床和检验科室紧密配合，打好一套“组合拳”。
给临床同事的建议是，在获取组织样本时，请尽可能获取足够的、富含肿瘤细胞的标本。对于内镜活检，多点取材、深部取材能有效提高成功率。组织离体后，请尽快放入足量的中性福尔马林中固定，并且固定时间最好不要超过24-48小时。送检时，也请务必填写清楚患者的病理诊断和样本情况，这能帮助我们更好地判断样本是否合格。
对于我们检验科来说，必须建立并严格执行一套标准操作程序。从样本接收到报告发出，每一步都要有明确的质量控制。要根据临床需求，合理选择和验证检测方法。对于NGS数据，要建立经过充分验证的生物信息学分析流程和阈值标准。当遇到检测失败或结果可疑时，别急着出报告，主动和临床医生沟通，坦诚说明情况，共同商讨是重新取样、换用其他检测方法，还是结合其他临床信息综合判断。
说到底，确保BRAF检测的准确和成功，是我们为结直肠癌患者铺好精准治疗道路的第一块坚实砖石。把这第一步走稳了，后面的治疗选择才能有的放矢。希望今天的分享，能让大家对检测背后的故事有更多了解。
